石蜡切片tunel实验染凋亡细胞-上海郑核

一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称 厂家 型号

脱水机 武汉俊杰电子有限公司 JJ-12J

包埋机 武汉俊杰电子有限公司 JB-P5

病理切片机 上海徕卡仪器有限公司 RM2016

冻台 武汉俊杰电子有限公司 JB-L5

组织摊片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 KD-P

烤箱 上海福玛实验仪器有限公司 DGX-9003B

载玻片 Servicebio

掌上离心机 Servicebio D1008E

脱色摇床 Servicebio TSY-B

涡旋混合器 Servicebio MX-F

移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573

显微镜 CIC XSP-C204

组化笔 Gene tech GT1001

2、主要实验试剂

试剂 厂家 货号

二甲苯 国药集团化学试剂有限公司

无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司

PBS缓冲液 Servicebio G0002

蛋白酶K Servicebio G1205

破膜液 Servicebio G1204

3%双氧水 Servicebio G0115

苏木素染液 Servicebio G1004

苏木素分化液 Servicebio G1039

苏木素反蓝液 Servicebio G1040

中性树胶 Servicebio G1403

Tunel试剂盒 Roche 11684817910

DAB显色剂 Servicebio G2111

二、石蜡切片tunel实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育25min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃水浴锅孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

6、加试剂3：切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-POD）覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

7、DAB显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为细胞核呈棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

9、脱水封片：将切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min -90%酒精5min -95%酒精5min -无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

三．结果判断

苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色

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